¿Qué es la espectroscopia de fluorescencia?

Por Paul Heney | 3 de mayo de 2023

La espectroscopia de fluorescencia es un método para determinar la composición de una muestra. Excita una muestra con radiación electromagnética, provocando que emita una radiación característica. Este es un método no destructivo para analizar la composición de la muestra. Los instrumentos utilizados para realizar espectroscopia de fluorescencia se conocen como fluorómetros. Lo más habitual es que la muestra se excite mediante luz ultravioleta y la luz emitida se encuentre en el espectro visible. Los fluorómetros de rayos X también se utilizan para el análisis elemental. La espectroscopia de fluorescencia se utiliza en muchos campos, incluidos los bioquímicos, médicos y de calidad del agua.

La fluorescencia es un proceso mediante el cual las sustancias absorben y reemiten radiación. Las moléculas tienen diferentes niveles de energía determinados por la posición de los electrones dentro de las capas y los estados vibratorios. Cuando una molécula se excita al absorber un fotón de radiación electromagnética, almacena esta energía momentáneamente saltando a un estado de energía superior, con un electrón moviéndose a una capa más alejada del núcleo. Debido a la atracción eléctrica entre el electrón y el núcleo, el electrón vuelve rápidamente al estado de menor energía y la energía se libera en forma de fotón. Estos fotones liberados son la radiación reemitida y tienen una frecuencia característica del estado vibratorio único de la molécula.

La espectroscopia de fluorescencia se puede realizar mediante fluorómetros de filtro o espectrofluorómetros. Los fluorómetros de filtro utilizan filtros para separar la radiación de excitación de la luz fluorescente emitida. Los espectrofluorómetros utilizan un monocromador de rejilla de difracción para separar la excitación y la luz fluorescente. En ambos casos, la fuente de excitación emite radiación de amplio espectro y luego la banda de frecuencia se reduce mediante un filtro o monocromador antes de llegar a la muestra. Luego se determina la frecuencia de la luz fluorescente haciéndola pasar a través de otro filtro o monocromador y fotodetector. La muestra emitirá fluorescencia en todas las direcciones, independientemente del ángulo de la radiación de excitación incidente. Por lo tanto, el detector normalmente se coloca perpendicular al haz de excitación para minimizar la luz transmitida o reflejada que llega al detector.

La fuente de luz de excitación puede ser una lámpara de vapor de mercurio, un arco de xenón, un LED o un láser. Una ventaja de utilizar un láser es que la banda de frecuencia muy estrecha elimina la necesidad de un monocromador o filtro de excitación. Sin embargo, hace que ajustar la frecuencia sea mucho más difícil y algo limitado. Un monocromador con una rejilla de difracción escaneable mecánicamente y filtros de polarización se puede ajustar para escanear una amplia gama de longitudes de onda.